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硫脂诱导的实验性变态反应性多发性神经炎

栏目: 内科 来源:跌IE

单位:管阳太 200040 上海医科大学神经病学研究所;秦 震 现在上海长海医院神经内科;曹小定 神经生物教研室 关键词:硫苷脂类;;神经炎;实验性变应性;;脱髓鞘疾病 【 摘要 】 目的 了解16型人乳头瘤病毒(HPV16)E6/E7、HSP70与角质形成细胞永生化及转

单位:管阳太 200040 上海医科大学神经病学研究所;秦 震 现在上海长海医院神经内科;曹小定 神经生物教研室

关键词:硫苷脂类;;神经炎;实验性变应性;;脱髓鞘疾病

  【摘要目的 了解16型人乳头瘤病毒(HPV16)E6/E7、HSP70与角质形成细胞永生化及转化之间的关系。方法 Lipofectamine介导法进行转染,以G418筛选阳性克隆,免疫印迹分析及免疫荧光双标记染色结合激光扫描共聚焦显微镜对HSP70和HPV16E6/E7在转染角质形成细胞中的表达进行了观察。结果 免疫印迹分析显示正常角质形成细胞和转染角质形成细胞均在相对分子质量70000处出现一条染色带,但转染细胞的着色深度明显强于正常细胞;激光扫描共聚焦显微镜观察也发现转染细胞中HSP70的表达明显增高,HSP70与HPV16E6/E7有共定位。结论 HPV16E6/E7可以诱导角质形成细胞中HSP70的高表达,这种高表达可能在角质形成细胞永生化甚至转化过程中具有重要作用。

Expression of 70-kD Heat Shock Protein in Keratinocytes Induced by Human Papillomavirus 16 E6/E7

LIAO Wenjun, YE Ling, LIU Yanfang, et al

. Department of Dermatology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032

  【Abstract】 Objective To investigate the relation between human papillomavirus 16 E6/E7 (HPV16 E6/E7),70000 heat shock protein (HSP70) and immortalization and transformation of keratinocytes. Methods Keratinocytes were transfected with lipofectamine and positive clones were selected by G418. The expressions of HSP70 and HPV16 E6/E7 by transfected keratinocytes were analysed by means of Western blot,double labelling immunofluorescent staining and laser-scanning confocal microscopy techniques. Results Results of Western blot analysis showed a specific band exhibiting a molecular weight of 70 000 in both normal keratinocytes and HPV16 E6/E7 transfected keratinocytes, but the staining was more intensive in transfected keratinocytes than in normal ones. The co-location of HPV16 E6/E7 and HSP70 in transfected keratinocytes were observed by laser-scanning confocal microscopy. Conclusion The high expression of HSP70 in transfected keratinocytes may be induced by HPV16 E6/E7 which suggests that HSP70 might play an important role in immortalization and even transformation of keratinocytes.

  【Key words】 Papillomavirus, human Heat-shock proteins Keratinocytes Transfection

  人乳头瘤病毒(HPV)是一种嗜上皮性小DNA病毒,基因组中共有8个开放读框(ORF),其中E6、E7ORF为调节病毒生长的编码区。已有报道将HPV16E6/E7转染角质形成细胞后可诱导角质形成细胞永生化。为了解HPVE6/E7、HSP70与角质形成细胞永生化及转化之间的关系,本实验将HPV16E6/E7癌基因转染角质形成细胞,并对转染角质形成细胞中HSP70的表达情况进行了观察。

  材料和方法

  (一)材料:质粒pLXSN16E6/E7由美国癌症研究中心Hutchinson教授惠赠,该质粒含16型人乳头瘤病毒E6/E7开放读框,约800bp;鼠抗人HSP70单克隆抗体(美国SantaCruz公司),兔抗人HSP70多克隆抗体(美国Dako公司),鼠抗HPV16E6、E7单克隆抗体,生物素化羊抗鼠IgG,FITC标记羊抗兔IgG,SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),Avidin标记TexasRed(Sigma公司),角质形成细胞无血清培养基(KC-SFM)、Lipofectamine转染试剂盒、G418(GibcoBRL)。

  (二)方法:

  1.pLXSN16E6/E7质粒的鉴定:碱裂法提取pLXSN16E6/E7质粒,以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,1%琼脂糖电泳进行鉴定。

  2.基因转染:取正常成人包皮(本院门诊手术室提供),胰酶消化法分离、培养原代皮肤角质形成细胞,用Lipofectamine介导法进行基因转染(质粒2μg,Lipofectamine10μL,转染6h)。72h后用G418(400μg/mL)对细胞进行筛选。2周后出现细胞集落(此时未转染组细胞已全部死亡),将G418改为200μg/mL维持剂量。收集G418抗性细胞用于做下述检测。

  3.免疫印迹分析:提取转染角质形成细胞及未转染角质形成细胞中的细胞内总蛋白,用紫外分光光度仪测定含量,取等量待测样品做SDSPAGE电泳,电转移至硝酸纤维素膜,分别加鼠抗人HSP70单抗、生物素化羊抗鼠IgG及SABC复合物,4-氯-1-萘酚显色。

  4.免疫荧光双标记染色及激光扫描共聚焦显微镜观察:将兔抗人HSP70多抗和鼠抗HPV16E6/E7单抗混合加至细胞铺片上,37℃孵育1h,加生物素化羊抗鼠IgG和FITC标记的羊抗兔IgG混合液,37℃孵育1h;加Avidin标记的TexasRed,孵育1h,无荧光缓冲甘油封片后在激光扫描共聚焦显微镜下观察。FITC和TexasRed的激发波长分别是488nm和568nm。

  结果

  1.pLXSN16E6/E7质粒的酶切鉴定:质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后,1%琼脂糖电泳可见1条800bp的目的片段和载体片段(图1),证明所获质粒确为pLXSN16E6/E7。

1 pLXSN16E6/E7酶切鉴定P:pLXSN16E6/E7:EcoRⅠ+BamHⅠ,M:λDNA/HindⅢMarker

  2.免疫印迹分析:正常角质形成细胞及转染角质形成细胞均在相对分子质量70000处出现1条染色带,但转染组的染色深度明显强于未转染组(图2),提示转染组细胞中HSP70的表达较未转染组明显增强。

硫脂诱导的实验性变态反应性多发性神经炎

2 免疫印迹分析A:E6/E7转染角质形成细胞,B:正常角质形成细胞,M:Marker

  3.免疫荧光双标记染色及激光扫描共聚焦显微镜观察:正常角质形成细胞内仅表达HSP70(FITC绿色荧光),且荧光强度较弱;而pLXSN16E6/E7转染角质形成细胞中则可见到较强的FITC绿色荧光(高表达HSP70)和TexasRed红色荧光(表达HPV16E6/E7),双标记结果可见由HSP70的绿色荧光与HPV16E6/E7的红色荧光重叠形成的黄色荧光(图3~5)。提示正常角质形成细胞可构成性表达HSP70,而转入的HPV16E6/E7在角质形成细胞中表达后,则可诱导HSP70的高表达。

3 E6/E7转染角质形成细胞表达HSP70(FITC绿色荧光)

4 E6/E7转染角质形成细胞表达E6/E7(TexasRed红色荧光)

5 转染角质形成细胞中E6/E7与HSP70共定位(黄色荧光)

  讨论